Kultur Jaringan Chrisanthenum

Persipan Eksplan
Dalam persiapan eksplan tanaman krisan tanman induk harus benar-benar sehat tidak terserang hama dan penyakit karena pada saat tanman di perbanyak maka khususnya penykit dapat menular ke keturunannya. Hal ini dapat berdampak kegagalan total pada saat pertumbuhan di lapangan terbuka. Oleh kara itu pemilihan ekspaln harus kondisi bebas dari hama dan terutama bebas dari penyakit.
Cara pengambilan eksplan adalah sebagai berikut:
a. Menyiapkan alat dan bahan
b. Ambil eksplan krisan dengan memotong pada bagian nodus atau tunas pucuk krisan yang masih menguncup.
c. Pengambilan ekplan disarankan harus yang masih muda.

2. Pembuatan Media
Dalam pembuatan media, langkah pertama adalah membuat larutan stok dari media terpilih. Penggunaan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali pembuatan media. Selain itu, juga sering timbangan dibutuhkan untuk menimbang dalam jumla kecil yang tidak tersedia dalam laboratorium. Dalam pembuatan larutan makro dibuat dipisah menjadi dua yaitu larutan stok makronutrien 1 dan makro nutrient 2. Untuk bahan makronutrient 1 hanya NH4NO3 dan sisanya adalah bahan makronutrien 2.

a. Cara pembuatan Larutan Stok Makro 2
Langkah pembuatan laruta stok II dengan 20x Konsentrasi:
a) Menimbang 38000 mg KNO3, 8800 mg CaCl2. 2H2O, 3400 mg KH2PO4, 7400 mg MgSO4. 7H2O menggunakan timbangan analitik yang ditempatkan pada plastik berbahan licin.
b) Melarutkan setiap bahan kimia secara satu per satu.
c) Memasukkan senyawa KNO3 pada tabung erlenmeyer dengan menambahkan aquades secukupnya sekitar 150 cc.
d) Mengaduk menggunakan magnetic stirer hingga homogen
e) Masukkan pada labu ukur yang berukuran satu liter
f) Memasukkan kembali CaCl2. 2H2O dengan menambahkan aquades secukupnya, dengan diaduk menggunakan hiot plate magnetic stirer hingga homogen.
g) Mencampurkan larutan CaCl2. 2H2O dengan larutan KNO3 tesebut pada labu ukur
h) Untuk KH2PO4 dan MgSO4. 7H2O cara pelarutannya sama dengan KNO3
i) Jika bahan senyawa larutan makro telah lengkap tambahkan aquades hingga volume larutan stok 100 ml atau 1 liter.
j) Mengaduk pada magnetic stirer hingga homogen
k) Pindahkan pada botol dengan memberi label tanggal pelarutan dan konsentrasi penggunaan.
l) Menyimpan dalam lemari es.

b. Cara Pembuatan Larutan Stok Makro 1.
Dalam pembuatan makro 1 yaitu NH4NO3 kebutuhan pada tanaman itu adalah 1650 mg/ L. Dibuat larutan makro 1 ini yaitu 1 liter untuk 20 x konsentarasi.
Jadi untuk pengambilan makro 1 yang akan di timbang adalah 33 gram dan pengambilan 50 ml/ L.
Lalu di tuangkan kedalam labu erlenmayer dan tambahkan aquades sekitar 150 cc dan di adauk di atas magnetik stirer sampai homogen.
Setelah itu tuangkan kedalam labu ukur yang berukuran 1 liter dan tera hingga tepat.

c. Cara pembutan Larutan Stok Mioinositol
Mioinositol yang di butuhkan oleh tanaman adalah 100 mg/L dan akan di buat menjadi 8 L untuk pengambilan 80 ml. Sehingga konsentrasinya adalah 8 kali.
Jadi untuk pengambilan mioinositol yang akan di timbang yaitu 0.8 gram.
Setelah itu tuangkan ke dalam labu erlenmayer dan tambahkan aquades secukupnya sekitar 150 cc. Hal ini berguna hanya untuk pelarut saja, lalu aduk dengan menggukan magnetik stirer hingga homogen. Setelah itu tuangkan ke dalam gelas ukur, tera hingga tepat.

d. Cara Pembuatan Larutan Stok Vitamin
Dalam pembuatan larutan stok vitamin ini terdapat beberapa yang akan di campurkan, yaitu:
Tabel 2. Senyawa vitamin yang dibutuhkan oleh tumbuhan
1. Glycine 2.0 mg/L
2. Asam nikotin (Nicotinic acid) 0.5 mg/L
3. Pyridoxin HCl 0.5 mg/L
4. Thiamin HCl 0.1 mg/L
Larutan stok vitamin yang akan dilarutkan adalah 200 ml dengan pengambilan 10 ml dengan konsentrasi 20 kali.
Jadi pengambilan vitamin untuk di timbang adalah:
1. Glycine 0.04 gr
2. Asam nikotin (Nicotinic acid) 0.01 gr
3. Pyridoxin HCl 0.01 gr
4. Thiamin HCl 0.002 gr
Setelah itu masing masing di larutkan dengan aquades secukupnya sekitar 150 cc ke dalam labu erlenmayer di magnetic stirer.
Gabungkan semua vitamin yang telah dilarutkan ke dalam gelas ukur, tera hingga mencapai 200 ml.

e. Cara Pembuatan Larutan Stok Fe-EDTA
Fe EDTA yang di butuhkan oleh tumbuhan adalah 37,3 dan akan di buat menjadi 200 ml dan pengambilannya sebesar 10 ml.
Jadi pengambilan FeEDTA yang akan di timbang adalah sebesar 0.746 gram.Setelah itu di larutkan kedalam labu erlenmayer dan ditambah dengan aquades sebanyaj 150 cc di magnetik stirer.
Setelah itu tuangkan kedalam gelas uku, tera samapi 200 ml.

f. Cara Pembuatan Larutan Stok Mikro
Larutan mikro merpakan zat anorganik yang dalam jumlah sedikit namun larutan ini sangat dibutuhkan sekali oleh tumbuhan karena dapat berpengaruh kepada proses fisiologi dan organisme pada pertumbuhan.
Untuk pembuatan larutan mikrodibutuhkan keterampilan dan ketelitian kareana penimbangan larutan mikro ini sangat detail sekali.
KI o,83
MnSO4.4H2O 6,2
H3BO3 22,3
ZnSO4.7H2O 8,6
Na2MoO4.2H2O 0,25
CuSO4.5H2O 0,025
CoCl2.6H2O 0,025

Kepekatan larutan stok ini 20 kali. Larutan stok yang akan dibuat adalah 200 ml dengan pengambilan 10 ml/ L.
Jadi pengambilan senyawa mikro untuk di timbang adalah:
Table 5. Senyawa mikro yang harus di ambil untuk ditimbang

1. KI 0.0166 gr
2. MnSO4.4H2O 0.124 gr
3. H3BO3 0.446 gr
4. ZnSO4.7H2O 0.175 gr
5. Na2MoO4.2H2O 0.005 gr
6. SO4.5H2O 0.0005 gr
7. Cu 0.0005 gr


g. Cara pembuatan Media
Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat tergantung pada media yang di gunakan. Media kultur jaringan tidak hanya menyediakan unsur-unsur hara makro dan mikro, tetapi juga karbohidrat yang pada umumnya berupa gula untuk menggantikan karbon yang biasanya didapat dari atsmosphere melalui fotosintesis.
Untuk media dasar tanaman krisan ini menggunakan MS=0. karena tanpa menggunakan hormone krisan dapat membentuk oragannya sendiri.
Jika tujan pertama ingin memunculkan tunas maka subkultur kedua adalah pertunasan dengan di bantu oleh senyawa hormone.
Dalam kultur jaringan pula langkah terakhir dalm subkultur adalah pengakaran. Karena subkultur ini bertujuan untuk membentuk akar-akar yang dapat menopang tumbuhan tersebut.

1). Pembuatan Media MS 0
Cara kerja
(1). Menyiapkan alat dan bahan
(2). Menimbang sukrosa, agar dan myoinositol
(3). Melarutkan gula dalam aquadest
(4). Melarutkan myoinositol dalam aqudest
(5). Masukan agar dalam panci, tambahkan aquadest secukupnya, aduk rata diatas kompor hingga mendidih
(6). Tera larutan makro 1, makro 2, mikro, Fe EDTA, mioynositol dan larutan sukrosa
(7). Pindahkan pada wadah yang lebih besar
(8). Gabungkan semua larutan dan aduk hingga rata
(9). Tera hingga 1 liter
(10). Siapkan botol atau tabung reaksi yang sudah di beri label
(11). Ukur ph larutan 5.5-5.8
(12). Jika terlalu asam tambahkan NaOH dan jika terlalu basa tambahkan HCl hingga sampai ph yang di inginkan
(13). Tuangkan kedalam botol kultur sebanyak 30 botol, tutup rapat
(14). Sterilkan dengan autoklaf selam 20 menit, dengan suhu 121 oc dan dengan tekanan 1.5-1.7 psi
(15). Simpan di ruangan penyimpanan

2). Cara Pembuatan Media Untuk Pertumbuhan Tunas
Untuk pembuatan media pertumbuhan tunas carakerjanya sama dengan pembuatan media MS penuh, akan tetapi media ini di tambah dengan hormone. Hormone ini untuk mengatur pertumbuhannya. Pengaturan hormone yang tepat akan mempengaruhi pertumbuhan sesui dengan keinginan kita. Namun di BPTP ini tanman krisan dari kultur jaringan tidak perlu melewati kalus terlebih dahulu karena tanaman krisan ini akan langsung menjadi bibit krisan yang unggul.

3). Cara Pembuatan Media Pengakaran krisan
Cara pembuatan media pengakaran krisan
(1). Menyiapkan alat dan bahan
(2). Menimbang sukrosa, agar dan myoinositol
(3). Melarutkan gula dalam aquadest
(4). Saring air kelapa dengan kertas saring
(5). Melarutkan myoinositol dalam aquadest sebanyak 80 cc
(6). Masukan agar dalam panci, tambahkan aquadest satu liter, aduk rata diatas kompor hingga mendidih
(7). Tera larutan makro 1, makro 2, mikro, Fe EDTA, Ga3, mioynositol dan larutan sukrosa, tera sa,pai 2 l dengan menambahkan aquadest
(8). Pindahkan pada wadah yang lebih besar
(9). Tera air kelapa hingga 2 liter dengan menambahkan aquadest
(10). Gabungkan semua larutan dan aduk hingga rata
(11). Ukur ph larutan 5.5-5.8
(12). Jika terlalu asam tambahkan naoh dan jika terlalu basa tambahkan hcl hingga sampai ph yang di inginkan
(13). Tuangkan kedalam botol kultur sebanyak 240 botol, tutp rapat
(14). Sterilkan dengan autoklaf selam 20 menit, dengan suhu 121 oc dan dengan tekanan 1.5-1.7 psi
(15). Simpan di ruangan penyimpanan



3. Sterilisasi eksplan
Dalam kultur jaringan, inisiasi kultur yang bebas dari kontaminan merupakan merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapang mengandung debu, kotoran-kotoran, dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya.
Keadaan ini mengharuskan kita untuk membebaskan ekspalan pada bebrbagai kontaminasi baik dari mikroorganisme manapun. Namun sterilisasi setiap ekspalan tergantung kepada kondisi eksplan tersebut.



b. Cara sterilisasi eksplan pada tanaman krisan.
(1). Menyiapkan alat dan bahan
(2). Ambil ekspan yang telah di stek dari pohon induk
(3). Cuci dengan air mengalir
(4). Setelah itu cuci kembali menggunakan sabun (sunlaigh) hingga bersih, bilas dengan air mengalir
(5). Siapkan bahan-bahan seperti clorox, dan banlet
(6). Setelah ditiriskan kurang lebih dari 20 menit
(7). Masukan kedalam gelas baker
(8). Tuangkan aquadest hingga terbenamnya eksplan lalu goyang-goyangkan secara memutar
(9). Buang air aquadest, lalu masukan banlate dan goyang-goyangkan selama 20 menit
(10). Setelah itu buang banlet tersebut lalu bilas dengan aquadest
(11). Masukan clorox 30% dan goyang-goyang secara memutar selama 7 menit
(12). Setelah itu bilas kembali dengan aquadest
(13). Masukan kembali larutan clorox 20 % dan goyangkan secara memutar selama 5 menit
(14). Bilas dengan aquadest
(15). Setelah itu msukan kembali clorox 1% dan goyangkan secara memutar selama 1 menit
(16). Bilas dengan aquadest
(17). Setelah dibilas dengan aquadest, masukan kembali air aquadest secukupnya agar terhindar dari proses pencoklatan (browning)
(18). Tanaman siap di inokulasi

4. Inokulasi eksplan
Penanaman eksplan ke dalam geals kultur atau ke dalam tabung reaksi yang berukuran besar disebut dengan inokulasi. Kegiatan ini dilakukan setelah eksplan disterilisasi, diawali dengan memotong bagian permukaan eksplan.
Caranya penanamanya yaitu:
a. Siapkan alat dan bahan
b. Celupkan pinset dan pisau kedalam alcohol, lalu baker
c. Ambil eksplan yang berupa pucuk
d. Buang semua daun yang berada di bawah pucuk yang masih kuncup
e. Buka tutup gelas kultur atau tutup tabung reaksi lalu lewatkan ke pada api
f. Ketika akan ditanam eksplan di lewatkan dulu ke api
g. Letakan atau tancapkan eksplan ke dalam media
h. Tanam sampai lima ekspaln untuk di gelas kultur, satu eksplan untuk di tabung reaksi.
i. Jika ingin menutupnya maka pebutup tersebut harus dilewatkan kembali kepad api
j. Beri lebel tanggal penanaman dan varietas tanamn.
k. Tempatkan di ruang pertumbuhan

5. Subkultur
Cutting atau Multipikasi bertujuan untuk memperbanyak propagul sedangkan, Sub kultur adalah usaha untuk menggantikan media dalam kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus dapat terpenuhi. Berikut ini adalah uraian tentang teknik pelaksaan sub kultur pada media padat. Dari media pertama, kultur dipindahkan ke media regenerasi selama sekitar 2-3 bulan.
a. Sipakan alat dan bahan
b. Celupkan pinset dan pisu kedalam alkohol
c. Lalu bakar dengan api di bunsen
d. Ambil tanman menggunakan pinset yang berada di gelas kultur atau di tabung reaksi dengan cara mernarik dahannya.
e. Potong pada bagian nodus atau tunasnya
f. Ambil potonganya setiap 1 smpai dengan 2 buah potongan nodus atau pucuk.
g. potong daun yang masih menempel pada pucuk atau nodus.
h. Lalu siapkan gelas kultur atau tabung reaksi yang berisi media
i. Buka tutupnya lalu lewatkan kedalam api bunsen
j. Tancapkan kembali potongan nodus atau pucuk yang telah terbentuk kedalam gelas kultur sebanyak 5 buah dan ke dalam tabung reaksi sebanyak 1 buah.
k. tutup kembali dengan penutupnya namun lewatkan kembali pada api, tutup dengan rapat.
l. Berikan lebel kembali.

6. Aklimatisasi dan Usaha Pemindahan Tanaman Hasil Kultur Jaringan ke lapang.
Untuk proses aklimatisasi pada PKL yang telah dilakukan, planlet yang berada pada botol di ditempatkan pada ruangan dengan kondisi lingkungan luar selama 1-2 minggu dengan bantuan paranet dengan cahaya masuk 60%, hal ini untuk mengkondisikan tanaman pada kondisi lapangan serta untuk menekan respirasi yang berlebihan pada tanaman itu sendiri karena lingkungan iklim mikro masih dapat digunakan oleh tanaman tersebut.
Setelah tanaman tersebut memiliki daun yang hijau seperti tanaman yang berada di lapangan tanaman bisa di aklimatisai dengan menggunakan fungisida dan baktersida atau menggunakan baiclean atau sama sekali tidak menggunakan apa-apa, jadi bisa langsung tanam ke dalam media, jika media tersebut steril bebas dari mikroorganisme.
Untuk media yang digunakan adalah arang sekam yang telah disterilisasi namun arang sekam ini dapat di beli ke para pedagang. Arang sekam ini sangat baik sekali terhadap proses penyemaian pada induk yang akan diperbanyak, karena pH yang netral, remah, dan dapat mengikat air dengan cukup baik, sehingga udara bisa masuk kedalam media dan akar sehingga dapat menyerap udara dengan baik. Pemakaian arang sekam harus diganti jika sudah terdapat nematode-nematoda serta mikroorganisme yang dapat menggangu proses pertumbuhan. Setelah itu tanaman dapat di stek pada umur 14 hari dan di berikan penutup plastic bening.
Stek tanman induk sangat penting sekali agar dapat menghasilkan bibit yang unggul, seragam, dan berkualitas. Untuk stek tanman induk sendiri terdapat metode yang dapat mempertahankan kualitas tanaman sehingga tanman bias di perbanyak sesuai dengan keinginan dengan sama seperti induknya. Cara-cara stek sebagai berikut:
a. Krisan yang berumul 14 hari di perkirakan sudah mempunyai 7 helai daun. Tanman induk ini dapat di stek namun ditinggalkan empat daun di bawahnya, hal ini dilakukan karena untuk memacu tunas lateral tumbuh kembali karena setiap daun memiliki cadangan makanan yang dapat menumbuhkan tunas lateral tersebut dan jika daun tersebut tidak ada atau di sisakan dua maka proses penumbuhan tunas lateral akan sulit karena cadangan makanan pada daun yang sedikit akan disebarkan kesetiap organ tumbuhan sehingga penyuplaian cadangan makanan akan sedikit.
b. Setelah 14 hari kembali tanamn krisan yang telah dipotong dan menyisakan empat buah helai daun dan di setiapiak daun kan tumbuh tunas lateral yang seragam. Namun pertumbuhan tunas lateral atas akan lebbih dulu berkembang dibandingkan dengan yang bawah. Pemotongan dapat dilakuna ke pada dua tanaman yang timbul pada tunas lateral namun kembali sisakan dua daun untuk menumbuhkan kembali tunas lateral. pemotongan ini dilakukan pada tunas lateral bawah.
c. Tanaman yang baru akan muncul pada ketiak daun yang telah diambil bagian atas tanamannya. Pemotongan ini dilakukan terus menerus selama 5 bulan, namun seringkali tanaman induk ini dapat bertahan sampai satu tahun jika kualitasnya masih baik.